▏ 定義

▏ 基本原理

我們經(jīng)常使用的轉(zhuǎn)染化學(xué)試劑有Lipofectamine/CaPO₄/FuGene/PEI等，原理基本是相同的：

1. 在體外混合質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑，質(zhì)粒DNA帶負(fù)電荷，轉(zhuǎn)染試劑帶正電荷，由轉(zhuǎn)染試劑包裹質(zhì)粒DNA在體外形成穩(wěn)定的復(fù)合物；

2. 外圍帶正電荷的復(fù)合物，接觸到帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，穿透細(xì)胞膜，形成Endosome（一種真核細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)合細(xì)胞器，屬于囊泡結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞內(nèi)吞作用中物質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵環(huán)節(jié)）；

3. 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放外源的質(zhì)粒DNA，DNA通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核，參與外源基因的表達(dá)。

 

 

▏ 瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定整合表達(dá)

 

 

 

常見(jiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，沒(méi)有定點(diǎn)的、特殊的整合機(jī)制，因此當(dāng)質(zhì)粒被遞送到細(xì)胞核中，整合是隨機(jī)發(fā)生的，而且只有一小部分質(zhì)粒會(huì)隨著細(xì)胞DNA復(fù)制過(guò)程中的斷裂，經(jīng)過(guò)修復(fù)機(jī)制的作用，被整合到宿主的染色體基因組中。
 

因此我們總結(jié)幾個(gè)重要的特點(diǎn)：

1. 隨機(jī)整合，整合效率低，不一定會(huì)整合到轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)；

2. 大量未整合的質(zhì)粒（以1x10e6轉(zhuǎn)染5 μg為例，以pcDNA3.1載體加上3000bp的目的基因?yàn)槔?，大約是5.37*10e11 copies），隨著細(xì)胞分裂慢慢被稀釋或降解；

3. 一般24-96小時(shí)會(huì)形成一個(gè)瞬時(shí)表達(dá)的最高峰；

4. 被整合的拷貝需要經(jīng)過(guò)抗性（antibiotic）篩選得到陽(yáng)性細(xì)胞，并且后期需要抗性維持壓力；

5. 因?yàn)槭峭ㄟ^(guò)DNA斷裂修復(fù)重組進(jìn)去的，所以后期也存在這個(gè)位置再次斷裂的可能性，進(jìn)而破壞了目的基因，因此可以說(shuō)穩(wěn)定性是個(gè)挑戰(zhàn)，建議做單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株，做傳代穩(wěn)定性分析；

6. 線性DNA比環(huán)狀DNA整合得更有效率，但是線性DNA比環(huán)狀DNA更難遞送；

7. 不同細(xì)胞類型差異較大，表現(xiàn)在“遞送差異”和“整合差異”上；

8. 遞送的化學(xué)試劑，多少存在毒性，需要平衡遞送效率和毒性；

9. 被遞送的質(zhì)粒要去內(nèi)毒素，內(nèi)毒素會(huì)引起免疫反應(yīng)。

  

▏ 應(yīng)用場(chǎng)景

1

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，追求瞬間高拷貝/超拷貝的蛋白表達(dá)

2

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建，生物安全等級(jí)低，對(duì)整和效率、整合位置要求不高


 

▏ 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)

科佰生物提供“質(zhì)粒隨機(jī)整合系統(tǒng)”穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)，利用該系統(tǒng)，我們已經(jīng)成功構(gòu)建超過(guò)500株穩(wěn)定細(xì)胞株的模型，有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，歡迎溝通咨詢。

		質(zhì)粒轉(zhuǎn)染		病毒感染	Flp-FRT系統(tǒng)	轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)	基因編輯
		脂質(zhì)體	電轉(zhuǎn)	慢病毒
適用細(xì)胞		部分細(xì)胞	幾乎所有細(xì)胞	幾乎所有細(xì)胞	內(nèi)部4種細(xì)胞	幾乎所有細(xì)胞	部分細(xì)胞
轉(zhuǎn)染/感染效率		低	中	高	高	高	低
隨機(jī)整合		是	是	是	否	-	否
生物安全等級(jí)		BL1	BL1	BL2	BL1	BL1	BL1
基因裝載能力		-	-	<4-5k	-	-	-
陽(yáng)性率		低	高	高	高	高	低
周期	基因合成	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周
	病毒包裝	-	-	1周	-	-	-
	混合克隆篩選	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周
	單克隆篩選	>3 周	>3 周	>3 周	可選	可選	>3 周
	合計(jì)	> 8-10 周	> 8-10 周	>9-11周	5-7 周	5-7 周	> 8-10 周
工作負(fù)荷		高	中	中	低	低	高